本文來源： BioArt
撰文、責編丨迦溆
2019年諾貝爾生理或醫學獎在瑞典卡洛琳斯卡醫學院揭曉，授予哈佛醫學院的William G.Kaelin，牛津大學的Peter J.Ratcliffe以及約翰霍普金斯大學的Gregg L.Semenza.，以表彰他們在低氧感應方面（"for their discoverys of how cells sense and adapt to oxygen availability"）做出的貢獻。值得一提的是，這三位科學家2016年曾獲得拉斯克基礎醫學獎。
人類和哺乳動物感知氧氣的重要性自不必多說，在不同氧氣濃度下，細胞會做出精細反應并進行適應性的調節，揭示細胞感知氧的分子機制為包括腫瘤、心血管病、黃斑退行性病變等多種疾病的臨床治療開辟了新路徑。
2016年的拉斯克基礎醫學獎授予William G.Kaelin、Peter J.Ratcliffe和Gregg L.Semenza之后，Cell雜志邀請了腫瘤代謝的知名專家Craig B.Thompson教授專門撰寫了題為Into Thin Air: How We Sense and Respond to Hypoxia的文章介紹他們的重要發現【1】。
這篇Cell文章提到，三位科學家是分別獨立展開的系列工作。整個工作的源頭還要從關鍵的促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）說起。人類和哺乳動物的體內需要紅細胞作為氧氣載體然后輸送到全身，而如果氧氣缺乏或貧血會導致來源于腎臟分泌的EPO刺激骨髓生成新的紅細胞，從而提高氧氣的運輸能力（注：人源EPO是1977年被純化出來，文章發表在JBC上【2】）。
盡管很早就知道EPO刺激紅細胞生產，但是細胞如何感應氧氣從而調控EPO的表達呢？三位獲獎人的工作正是回答了上述重要問題。接下來，我們逐步回顧一下各個重要的發現歷程。
1991年，Gregg L.Semenza作為第一作者在PNAS發表題為Hypoxia-inducible nuclear factors bind to an enhancer element located 3' to the human erythropoietin gene的論文（諾獎委員會的第1篇參考文獻）【3】，Semenza等人通過DNase I超敏感位點研究（當某基因處于活躍轉錄狀態時，含有這個基因的區域對于脫氧核糖核酸酶DNase I的敏感性要比無轉錄活性區域高百倍以上）找到了4個或者多個不同的核因子，發現至少有兩個是在肝臟和腎臟的貧血或缺氧條件下誘導的，這些結果對于隨后找到關鍵的低氧誘導因子具有重要的意義，這種因子當時就被命名為“Hypoxia-inducible factors”【3】。
隨后就是如何去尋找鑒定當時所謂的Hypoxia-inducible factors了。
Gregg Semenza. IMAGE CREDIT： JOHNS HOPKINS MEDICINE
諾獎委員會的press release中主要提了1995年的PNAS（諾獎委員會的第2篇參考文獻），這篇文章主要確定了HIF-1包含兩個蛋白的序列：HIF-1α和HIF-1β，分析了蛋白的結構域，并且比較果蠅中的同源蛋白Per和Sim【4】。
事實上，在1991年和1995年分別發表的PNAS文章的期間，Semenza和華人學生Guang L. Wang一起還發表了大量相關的工作，包括1993年發表在JBC上的文章（被引超過1000次）主要描述了HIF-1與DNA結合的活性相關研究【5】，而1993年PNAS論文則是證明了HIF-1在低氧誘導的情況下識別序列在不同類型的哺乳細胞中具有一致性【6】。事實上，1995年一月份發表在JBC上的論文（被引超過2100次）【7】也非常重要，這篇文章主要分離純化和鑒定了HIF-1，明確提出HIF-1主要以異二聚體形式存在，主要由120 kDa的HIF-1α和91-94 kDa的HIF-1β組成【7】。
Semenza等繼續對HIF-1進行研究發現HIF-1α還能夠誘導在血管生成中起重要作用的血管內皮生長因子VEGF（ vascular endothelial growth factor ）【8】，這表明HIF-1α作為氧傳感的核心因子對調控血管系統的生成也具有重要意義，相關工作1996年發表在MCB雜志上（被引3900多次）【8】。1998年，Semenza等發表在Gene & Dev上的而研究則是通過制備HIF-1α突變的轉基因小鼠確定其體內生物學功能，研究發現HIF-1α功能缺失的情況下，血管發育和氧依賴性基因的表達收到嚴重損害，而且導致胚胎致死【9】（被引近2500次）。
小鼠缺失HIF-1α后的表型。圖片引自【9】
接下來談談Peter J.Ratcliffe的主要貢獻。
時間回到1993年。Ratcliffe組1993年發表在PNAS雜志上的工作【10】，利用瞬時基因轉染的報告基因系統偶聯到促紅細胞生成素基因EPO 3'的轉錄增強子，結果顯示了氧氣感知系統在哺乳動物細胞中廣泛存在，而不限于腎臟和肝臟細胞亞群，這篇文章和Semenza組1993年的PNAS工作結論有些相似之處。
隨后，1994年Ratcliffe組繼續在PNAS雜志上發表論文【11】，這篇文章的主要意義在于，該研究發現了在低氧誘導情況下，糖酵解過程中的重要基因磷酸甘油酸激酶PGK（phosphoglycerate kinase）和乳酸脫氫酶LDHA（ lactate dehydrogenase A）也出現了類似EPO基因被誘導表達的情況。這個研究的意義在于，HIF-1不僅僅在機體水平上負責調控缺氧的適應，而且在細胞水平上參與調解糖酵解的速率。事實上，現在關注腫瘤代謝研究的同行大多了解，HIF-1和c-Myc還有p53共同構成了調控糖酵解的核心轉錄因子（下圖）【12】。
c-Myc、 HIF1 和 p53 對糖酵解代謝途徑的調控。圖片引自【12】
下面再來談談第三位獲獎人William G.Kaelin。
Craig B.Thompson教授撰寫的文章中談到，Kaelin與專門做基礎研究的Semenza和Ratcliffe不同，他是一位臨床醫生。Kaelin有著較好的臨床訓練，他主要研究一種遺傳綜合征，即von Hippel-Lindau病（VHL病，常染色體顯性遺傳性癌癥易感性綜合征）。這種遺傳疾病會導致遺傳性VHL突變的家庭罹患某些癌癥的風險急劇增加。
1995年，Kaelin等人在Science上發表論文【13】，報道了VHL與Elongin B、Elongin C和CUL2形成復合物，該工作暗示了VHL/Elongin/CUL2復合物有可能起到泛素連接酶的作用，該工作為后續Ratcliffe小組1999年的Nature提供了重要的參考信息。
1996年（HIF-1正式被鑒定后的第二年），Kaelin等人發表在PNAS上的研究表明，VHL蛋白可以通過氧依賴的蛋白水解作用負性調節HIF【14】，而1999年Ratcliffe小組在Nature（諾獎委員會的第3篇參考文獻）上的工作進一步確定了VHL蛋白是一個蛋白復合物的成分之一，這個蛋白復合物和SCF（Skp1/Cdc53 or Cullin/F-box）這一大類泛素連接酶非常相似，正是由于VHL功能缺失導致了HIF蛋白不能被降解【15】，因此HIF蛋白的靶基因上調，導致了腫瘤的發生。
在搞清楚了VHL降解HIF-1蛋白之后，接著又有新的問題出現，在有氧氣的情況下，VHL如何降解HIF-1呢？也就是說，有什么氧特意依賴的方式降解HIF-1。
2001年，Kaelin組和Ratcliffe以“背靠背”的形式在Science雜志上發表論文（諾獎委員會的第4和第5篇參考文獻）【16，17】，研究發現了HIF-1α在氧氣存在的情況下多肽上的脯氨酸進行了羥基化作用，而且VHL正是特異性的結合了羥基化的HIF-1α，才導致了HIF-1α被降解。
接著問問題，是什么因素控制HIF-1α發生氧依賴性的羥化反應？
2001年，Ratcliffe組在Cell，Steve McKnight組在Science，Kaelin組先后在PNAS分別獨立報道了催化HIF-1α發生羥化反應的酶【18-20】。此外，2002年發表在Gene & Dev上的工作還表明發生在天冬氨酸殘基上的羥化反應可以阻止HIF-1α招募轉錄共激活因子【21】，事實上這是給HIF-1α上的雙保險，保證細胞內的HIF-1α充分被降解。
整個氧感知的機制發現歷程到這里基本上差不多了。
最后，談點個人感受，從本文所引用的參考文獻中發現，PNAS雜志是最大的贏家，事實上到后期的一些發表在CNS上的工作盡管也非常重要的，但是從原創性上講屬于“馬后炮”了，早期的一篇重要JBC也特別值得關注。
筆者從諾獎開獎之時起臨時準備稿件，差不多用了3個半小時了，希望這個梳理對大家深入了解整個氧感知的研究歷程有清晰的認識，時間匆忙，文章中的疏漏和訛誤之出在所難免，敬請讀者諒解。這篇文章算是對這個國慶長假的紀念！
花絮：Peter J. Ratcliffe在接到電話時正在寫基金。
William G.Kaelin,Jr.正獨自在家。
Gregg L. Semenza也正在家。
參考文獻
1、Thompson， C. B. (2016). Into thin air： How we sense and respond to hypoxia. Cell， 167(1)， 9-11.
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3、Semenza， G.L， Nejfelt， M.K.， Chi， S.M. & Antonarakis， S.E. (1991). Hypoxia-inducible nuclear factors bind to an enhancer element located 3’ to the human erythropoietin gene. Proc Natl Acad Sci USA， 88， 5680-5684
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